1. Mirror, mirror on the wall, which is the best cell of them all?
如果您正在考虑将器官芯片 (OOC) 技术纳入您的工作流程,您或您的团队可能不知道从哪里开始。使用商用解决方案(例如CN-Bio的PhysioMimix OOC),可以轻松实现从 2D 或更简单的 3D 类器官/球体检测的过渡。
对于已经选择了解决方案的人来说,您的下一个考虑因素是确保您生成的数据有意义。这里简化为5P:Prior , Planning , Pre-validation to ensure , Perfect assay , Performance.
在此阶段,我们无论怎么强调选择正确细胞的重要性都不为过。
2. 预验证原代人类细胞对于OOC的重要性
并非每个细胞在 OOC中都表现良好,也并非每个细胞类型都具有高程度的人类相关性!
图1 不同来源捐赠者的肝微组织
由于 OOC(也称为微生理系统 (MPS))的目的是尽可能地重现人类生理学,因此我们有目的地选择使用原代人类细胞,但是,即使您严格遵循解冻/接种方案,也不意味着您的细胞在 3D OOC 培养中表现良好(图1、图2)。
图2 良好/较差的肝脏微组织
在过去的五年里,CN-Bio测试了来自不同细胞供应商的 50 多个原代人肝细胞批次,其中超过60%未能达到我们可接受的性能标准,其中大多数甚至未能形成 3D 肝脏微组织。
我们计算出,确定两名通过验证程序的捐赠者大约需要花费 10-15,000 美元,并需要科学家花费 100 多个小时的时间,但这些时间花得值。
通过使用预先验证的细胞(如源自 LifeNetHealth LifeSciences 或 Lonza,被CN-Bio验证,随附验证报告的细胞),您将从跨实验的一致性和增强的数据稳定性中获益。
尽管我们鼓励客户尽可能使用我们目录中经过验证的细胞,但我们了解某些地理区域的进口限制会影响这一点。
3. 验证培养3D细胞的流程示例是什么样的?
CN-Bio已经开发了一个人体代谢紊乱疾病——非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的模型,使用了人肝细胞(PHHs)、肝星状细胞(HSC)和库普弗细胞(KCs)。让我们以此为例,为您介绍这三种细胞培养验证过程:
首先,您需要预先选择5-10个PHH供体,并确定所需的关键细胞健康和功能标志物,以比较每个供体的表现,包括通过/失败的阈值。为了评估 3D 支架上的组织形成,我们还建议进行组织特异性的免疫荧光染色和随后的共聚焦显微镜/分析,以从视觉方面确认您的3D培养物的质量。对于PHHs,我们随后量化各种功能性生物标志物,包括LDH、尿素、白蛋白和CYP3A4。
为了确保肝组织培养的持久性,使用您的OOC平台对选择的所有PHH供体进行为期14天的培养。每2-3天收集培养基样品,以监测细胞健康和功能,以评估供体培养是否在每个时间点保持在可接受范围内或之外,并表现出持续的功能。通常会运行此过程两次,以确保供体特性的可重复性。
以类似的方式,第二步涉及选择几个KCs供体,并测试它们对炎症刺激的反应,例如脂多糖(LPS)。为了评估它们的反应,我们量化炎症标志物,如白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNFα)。与一个或两个成功验证的PHH供体一起进行的共培养,为期14天,同时使用LPS作为KCs诱导剂。为了确保共培养细胞的性能保持在可接受范围内,我们在不同的时间点评估PHH的健康和细胞功能,以及KCs的炎症反应。
第三步是获取几个HSC供体,与经过验证的PHHs和KCs一起进行共培养。建立一个三重培养实验,测试多种PHHs、KCs和HSCs的组合,理想情况下创建不同的供体组合。在验证实验期间,我们使用CN-Bio的高脂培养基(HEP-Fat)培养细胞以诱导NASH表型。
与之前的阶段一样,我们将实验培养14天,以确保培养的持久性。然后选择HSC诱导剂,如转化生长因子β(TGFβ),这些诱导剂特异性激活HSCs。用这些诱导剂处理细胞,以确定共培养在诱导后是否产生更gao级的纤维化表型。
选择的终点测定与预定的通过/失败阈值需要包括纤维连接蛋白、组织抑制金属蛋白酶1(TIMP-1)等纤维化标志物以及脂肪和HSC激活的免疫荧光染色。那些在14天内表现稳定(即符合每种细胞类型的选择标准限度)的三细胞培养现在已经验证可供使用。
虽然档您获得经验,验证过程在程序中是合乎逻辑和简单的,但程序中的第一步才是关jian步骤。如前所述,大约60-70%的PHH供体无法在3D OOC环境中培养。当与良好的PHH供体一起培养时,其他细胞类型更有可能成功验证并接种。在CN-Bio的实验中,大约四分之一的三细胞培养组合失败。
提前告诉您,您需要预算数万(美)元,并考虑运行这样的研究,需要四到六个月的测试期。然而对于NASH,如果您愿意,也可以绕过这个过程!CN-Bio已将这一验证原则应用于一款名为“NASH in-a-box”的独特产品,该套件不仅提供了经过3D验证的共培养原代细胞,还包括解冻培养基、肝小组织质控试剂盒、专有的诱导NASH细胞培养基、Multi-chip Liver-12+芯片培养板耗材以及细胞培养用的培养基/补充剂。
结合软件引导的协议(可逐步引导您完成实验过程),该套件简化了整个工作流程,使您能够受益于CN-Bio十多年的经验。更重要的是,它们还为您提供了一个选择——是将宝贵的时间用于做出新的发现,还是用于验证细胞!
